protocoles

Publié le par Association Caouanne

        I.  Protocoles validés

 

Les objectifs à atteindre au cours des trois années de recherche sont énoncés ci-dessous puis repris dans la partie méthode avec le protocole correspondant.

Ces protocoles ont été validés par nos partenaires scientifiques. La responsable du projet s’est rendue à la Réunion du 19 au 24 avril. Cette semaine a permis de rencontrer et d’échanger avec  les responsables de l’Agence pour la Recherche et la Valorisation Marine, du Centre Kelonia et du Centre de Recherche et de Veille sur les Maladies Emergentes dans l’Océan Indien.  Puis, ils ont été soumis et validés par l’Institut Halieutique et des Sciences de la Mer de Tuléar du  28 au 30 avril.

 

Objectifs:

Ø  Déterminer la répartition et la prévalence de cette affection dans l'archipel Barren et l'existence d'autres foyers sur la côte ouest de Madagascar

Ø  Mettre en évidence le ou les agents étiologique(s) responsable(s) de l’apparition des lésions

Ø  Déterminer le rôle éventuel de cofacteurs environnementaux

Ø  Étudier l'évolution de cette affection

 

Méthode :

 

La collecte des données s'effectuera dans les îles Barren situées sur la côte ouest de Madagascar (cf. carte annexe 1 et 2). La méthode de capture utilisée est celle employée par les pêcheurs Vezo (Leroux, 2010). Elle consiste à capturer les tortues venant se nourrir sur le platier récifal, à marée haute. Quatre pêcheurs parcourent les zones d’alimentation grâce à une pirogue à moteur. Lorsque les tortues, venant respirer en surface sont repérées, le moteur est éteint et un filet de 160m X 5m à grandes mailles (20cm X 20cm) est mis à l'eau de façon à faire barrière entre les tortues et le large. Les pêcheurs retournent ensuite vers la côte et tapent sur la pirogue, les tortues effrayées se prennent ainsi dans le filet. Elles  sont immédiatement capturées par deux plongeurs, remontées à bord de la pirogue puis amenées à terre. Cette méthode permet de capturer principalement les tortues se nourrissant dans des zones de faible profondeur à savoir les Vertes (Chelonia mydas) et les Imbriquées (Erethmochelys imbricata). Dans cette région, les tortues Luth (Dermochelys coriacea), Caouanne (Caretta caretta) et Olivâtre (Lepidochelys olivacea) sont également présentes mais ne fréquentent pas ou peu les platiers récifaux. Une enquête sera donc menée auprès des pêcheries afin de déterminer si des individus, de ces trois dernières espèces,  ont été observés avec des lésions de type fibropapillomas.

 

 

Chaque individu capturé sera :

·         identifié (cf. clé de détermination en annexe 3)

·         bagué avec une bague de type Monel

·         mesuré avec un mètre ruban pour la longueur et la largeur courbe de la carapace et une toise pour la longueur et la largeur droite

·         pesé avec un dynamomètre

·         examiné afin de renseigner toutes les anomalies : blessures,  présence d’épibiontes, de parasites, de lésions (cf. ci-dessous pour le classement des tumeurs)…

·         sexé: le dimorphisme sexuel apparait lorsque la longueur courbe de la carapace est ≥ 80 cm (Taquet., 2007). En effet les mâles se distinguent des femelles par une queue supérieure à 20 cm (Wibbels., 1999 in Seminoff et al., 2002).

 

 Afin d'éviter toute contamination, un lot de matériel différent sera utilisé pour les tortues saines et les tortues présentant des tumeurs. L'ensemble du matériel sera désinfecté avec de l'alcool à 90° après chaque utilisation. Dans la pirogue, les tortues saines seront séparées des tortues présentant des lésions par une bâche hermétique.

 

Ø  Déterminer la répartition et la prévalence de cette affection dans l'archipel Barren et l'existence d'autres foyers sur la côte ouest de Madagascar

 

Le fibropapillomas y a été mis en évidence dans le cadre du projet « Diagnostic Environnemental et Social autour de la tortue marine de l'ouest de l'Océan Indien ». Ce projet, initié par Géraud Leroux, a été mené par le Muséum d’Histoire Naturelle de Genève de 2005 à 2010. Les îles prospectées lors de ces recherches sont : Nosy Maroantaly, Nosy Marify, Nosy Abohazo, Nosy Lava, Nosy Dondosy, Nosy Ampasy, Nosy Andrano et Nosy Manghily. Il a été mis en évidence une forte prévalence de tortues atteintes à Nosy Maroantaly et Nosy Marify (environ 25% des tortues capturées) contrairement aux autres îles où le fibropapillomas est rare (1,5%) voir absent (Leroux et al., 2010). Afin de compléter ces données et de connaître la répartition de cette affection dans l'archipel Barren, les 6 premiers mois de recherche seront consacrés à la collecte des données dans les îles non encore prospectées : Nosy Manandra, Nosy Mavony et Nosy Vao. Pour chaque île des sessions de cinq jours de capture par mois auront lieu de juin 2010 à décembre 2010.

 Des enquêtes seront également menées auprès des pêcheries et des organismes de protection du milieu marin de la côte ouest.

 

Ø   Confirmer le diagnostic de Fibropapillomas et mettre en évidence le ou les agents étiologique(s) responsable(s) de l’apparition des lésions

 

Lorsque les tortues marines présentent des lésions cutanées, simples ou multiples, dont la taille varie entre 0,1 et 30 cm de diamètre, on parle de fibropapillomas. Ce diagnostic doit être confirmé par l’observation histologique des lésions. Cette affection se caractérise par (Baboulin., 2008):

 

ü  Des modifications au niveau de l’épiderme :

-           hyperplasie (prolifération anormale des cellules)

 

-           hyperkératose orthokératosique (épaississement de la couche cornée) avec un stratum corneum plus épais que la normale, excepté pour les lésions des zones où la peau n’est pas cornée (muqueuse cloacale, conjonctive oculaire)

 

-           figures d’acanthose (épaississement anormal de la couche épineuse)

 

-           dégénérescence des cellules basales par gonflement ou vacuolisation conduisant au décollement du derme et de l’épiderme

 

-          dégénérescence par gonflement ou vacuolisation des cellules les plus superficielles du stratum spinosum, associée à une acantholyse (destruction des adhérences intercellulaires)

 

-          cellules des strates épineuse et cornée hypertrophiées

 

ü  Des modifications du derme

-          prolifération importante des fibroblastes dans le derme papillaire

-          derme papillaire très épaissi avec une distinction zone réticulaire/zone papillaire nette.

 

La photo ci-après montre différentes coupes histologiques de fibropapillome de tortue verte :

 

1) Fibropapillome cutané : prolifération fibreuse du derme papillaire dans l’épiderme hyperplasié avec formation de projections papillaires, la limite derme papillaire/réticulaire est marquée

2) Peau saine

3) Fibropapillome conjonctival : hyperplasie de l’épiderme sans orthokératose

4) Fibropapillome cutané : hyperkératose orthokératosique avec inclusions cornées

5) Fibropapillome cutané : dégénérescence par gonflement des cellules basales

6) Fibropapillome cutané : séparation du derme et de l’épiderme le long de la membrane basale

7) Fibropapillome cutané induit expérimentalement : formation d’une fissure entre l’épiderme et le derme avec une dégénérescence focale de la couche superficielle de l’épiderme

8) Fibropapillome cutané : changement spongiotique le long de la membrane basale

 

 

 

Photo histologie

Coupe histologique de peau de tortues  vertes  d’apres Herbst et al., 1999.

 

 

Durant ces 6 premiers mois, des prélèvements seront donc effectués sur les tortues présentant des lésions pour des analyses en histologie. Outre la confirmation du diagnostic de fibropapillomatose, ces analyses permettront également de mettre en évidence la présence d’organismes pathogènes (virus, bactéries, etc.) et seront complétées grâce à la microscopie électronique.

Pour chaque individu atteint un prélèvement de peau saine et un par lésion sera réalisé avec un trépan de biopsie de 6 mm. Les zones de biopsies seront désinfectées avant et après l'opération par de l'alcool à 70°. Les échantillons seront conservés dans la formaline à 10 % pour l'histologie et le glutaraldéhyde à 2,5 % pour la microscopie électronique. Ces échantillons seront ensuite traités et analysés au laboratoire de l'Ifremer de la Tremblade.

Un partenariat est à l’étude avec le Centre de Recherche et de Veille sur les Maladies Emergentes dans l’Océan Indien afin de déterminer le rôle d’un herpesvirus dans le développement des lésions. Quelques prélèvements seront réalisés cette année et analysés par le CRVOI, en fonction des résultats obtenus un protocole de recherche adapté sera mis en place.

 

Ø  Déterminer le rôle éventuel de cofacteurs environnementaux

 

D’après plusieurs études (Herbst., 1994, Balazs., 1999, Limpus & Miller., 1994), les tortues atteintes de fibropapillomas se concentrent dans les écosystèmes côtiers comme les lagons, les baies, les estuaires et notamment dans les zones soumises à une forte pression anthropique (agriculture, urbanisation, industrie, pêche…). Il est donc possible que certains facteurs environnementaux aient un effet cocarcinogène sur l’agent étiologique du fibropapillomas.

D’une part, des contaminants supprimeraient les fonctions du système  immunitaire empêchant les tortues de le reconnaître ou de l’éliminer (Herbst & Klein., 1995).

 

D’autre part, la présence du fibropapillomas a déjà été corrélée avec la présence de dinoflagellés ou de cyanobactérie produisant des biotoxines, promoteurs de tumeurs.

A Hawaii, dans les zones de forte prévalence (51 à 100% des tortues affectées par le fibropapillomas), le nombre moyen de Prorocentrum lima et Prorocentrum concavum  est de 178,3 à 279,9 cellules/g de substrat tandis que dans les zones où la prévalence  est inférieure à 1% le nombre de Prorocentrum spp est de 2,3 à 0 cellules/g (Landsberg et al., 1999).

De même à Moreton Bay en Australie et à Kaneohe Bay aux îles Hawaii, la prévalence du fibropapillomas a été positivement corrélée  avec la présence, dans les tissus des tortues atteintes, de lyngbyatoxine A. Cette toxine est produite par les cyanobacteries Lyngbya majuscula (Arthur et al., 2008).

 

Afin de déterminer l’existence d’un lien entre la présence de ces micro-organismes et la prévalence des tortues présentant des lésions, des prélèvements d’algues et de phanérogames seront réalisés dans les îles avec une faible prévalence de fibropapillomas (0 à 1,5%) : Nosy Andrano et Nosy Abohazo et dans celles avec des pourcentages élevés de tortues atteintes (25%) Nosy Maroantaly et Nosy Marify. Trois prélèvements par mois et par îlots seront effectués de juin 2010 à fin novembre 2010.  Lorsque la marée descend ou à la nage, environ 20g d’algue ou de phanérogame seront prélevés délicatement et mis dans un sac plastique fermé avec de l’eau de mer. Les échantillons seront conditionnés dans le noir. Afin de décrocher les micro-organismes de leur support, il faut secouer vigoureusement le sac pendant 30 secondes. Une fois les plus grosses fractions enlevées, laissez sédimenter. Le dépôt sera récupéré dans un flacon est fixé avec du formol à 3%.  Les échantillons seront observés au microscope optique afin d’identifier les espèces et leur abondance. Ces analyses auront lieu mi décembre au laboratoire de l’Agence pour la Recherche et la Valorisation Marine.

Si des algues toxiques sont mises en évidence, un protocole permettant d’identifier la présence de toxine dans les tissus des tortues atteintes et saines sera mis en place.

 

Ø  Étudier l'évolution de cette affection

 

La fibropapillomatose se caractérise par une dégénérescence des individus entrainant généralement la mort. Toutefois des régressions de la maladie ont déjà été décrites dans les îles d’Hawai (Benett et al., 2000) et aux îles Barren (Leroux et al, 2010).

Afin de comprendre l’évolution de cette affection, un suivi des individus capturés sera effectué de février 2011 à fin 2013 dans les îlots avec une forte prévalence. Les individus atteints subiront un examen précis visant à identifier le nombre de tumeurs présentes, leurs localisations et leurs tailles. Elles seront classées en quatre catégories de taille selon la méthode de Work et Balazs., 1999:

A : tumeurs de moins de 1 cm de diamètre

B : diamètre de 1 à 4 cm

C : diamètre de 4 à 10 cm

D : diamètre de plus de 10 cm

Un score de 0 à 3 sera assigné à chaque tortue. Ce score reflète la sévérité de l’affection :

0 : saine

1 : faiblement atteinte

2 : modérément atteinte

3 : très atteinte

 

Le score est déterminé grâce au tableau ci-dessous (Work et Balazs., 1999) :

 

  score tumeur

 

Ces informations seront complétées par un suivi photographique de chaque individu. Des photographies des parties antérieures, postérieures et des profils seront prises ainsi qu’un zoom de chaque zone présentant des lésions.

Une attention particulière sera portée aux yeux des tortues qui seront photographiés lors de chaque capture. En effet, un examen oculaire donne des indications complémentaires sur le stade du fibropapillomas (Benett et al, 2000) :

 

·         un œil de tortue saine présente une conjonctive postérieure foncée et plissée

oeil sain

 

·         l'apparition d'une ligne blanche au bord de la conjonctive, des tâches sur la conjonctive ou les deux serait un signe précurseur de la maladie.

 

oeil atteint  

 

 

·         une lésion oculaire en évolution aura une coloration blanchâtre/rosâtre et une forme verruqueuse, polypoïde ou pédonculée   

 

 

         

·         une lésion oculaire lisse, de coloration grise à noire marque une affection stabilisée ou en régression

 

 

·         une conjonctive décolorée, avec un tissu cicatrisé sans pli sont les marques laissées par une lésion qui a régressée

 

    oeil cicatrisé

 

Publié dans Recherche

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